核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,是生命最基本的物質(zhì)之一。核酸存在于所有動物細胞、植物細胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)的核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸的化學組成、核苷酸排列順序都不同。核酸主要包括RNA(核糖核酸)和DNA(脫氧核糖核酸),其中DNA是儲存、復制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎。
核酸提取的原則首先保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性,其次要排除其它分子的污染。
提取核酸時要注意簡化步驟,縮短提取時間;減少化學因素對核酸的降解;減少物理因素對核酸的降解:機械剪切力和高溫;防止核酸的生物降解。
核酸提取大致分為3大部分:破碎、提取、純化
細胞裂解法
1.物理方式:煮沸法、玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法、勻漿法
2.化學方式:表面活性劑(SDS法)、堿裂解法
3.生物方式:酶法(溶菌酶、蛋白酶K等)
常見樣本提取方法總結(jié)
濃鹽法:利用RNA和DNA在鹽溶液中溶解度不同,將二者分離
有機溶劑提取法:有機溶劑作為蛋白變性劑,同時抑制核酸酶的降解作用
高度梯度離心法:利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物
吸附材料結(jié)合法:①硅質(zhì)材料 高鹽低PH值結(jié)合核酸,低鹽高PH值洗脫②陰離子交換樹脂 低鹽高PH值結(jié)合核酸,高鹽低PH值洗脫③磁珠 磁珠微粒包裹上不同基因可吸附不同的目的物,從而達到分離目的
胍鹽提取結(jié)合二氧化硅吸附法
二氧化硅具有特異吸附核酸的特性,異硫氰酸胍可使細胞裂解,因此在高濃度異硫氰酸胍存在下,從細胞包括細菌或者病毒顆粒中釋放出來的核酸成分可以結(jié)合在二氧化硅上,利用此特性可提取血液和尿液中的DNA和RNA
Express RNA快速提取試劑
先達基因的RNA快速提取試劑,可在5min之內(nèi)快速完成對組織、血液、拭子、細胞等不同少量以及微量樣品中病毒的RNA提取和純化。利用產(chǎn)品提取獲得的RNA可直接應用于核酸擴增及檢測、體外逆轉(zhuǎn)錄、基因克隆、文庫構(gòu)建、雜交等多種生物學實驗及研究。
離心柱提取
離心柱技術是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法,屬于硅吸附方法的一種,在原理上可分為三個部分:
①利用裂解液促使細胞破碎,使細胞中的核酸釋放出來。
②把釋放出來的核酸特異吸附在特定的硅載體上,這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力,對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附,因而離心時被甩出柱子。
③把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來,分離得到純化的核酸。
磁珠法
依據(jù)與硅膠膜離心柱相同的原理,運用納米技術對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后,制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性,在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下,能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來,可應用于臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學研究等多種領域。